明星载体AAV的应用
摘要
腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)由于其良好的安全性和对各种靶组织的有效转导，已成为治疗各种疾病的主要基因传递平台AAVE币。然而，与传统抗体药物相比，病毒载体也存在一定的局限性，例如大规模生产和长期储存效率不高，产量低，纯度适中，保质期短。本篇文章将概要的介绍当前AAV工艺中面临的机遇与挑战。
前言
基因治疗是指将外源基因引入靶细胞，纠正或补偿基因缺陷或异常引起的疾病，以达到治疗目的AAVE币。这种策略对许多疾病都有希望，包括癌症、神经退行性疾病和心血管疾病，因此有非常广的市场（图1）。基因治疗的关键是使用安全有效的基因传递载体，如病毒载体和非病毒载体。病毒载体是常用的基因导入的方式之一，常用的载体主要有三种（表1）。其中腺病毒的载体由于转基因效率高，不受靶细胞是否分裂的限制，容易制的高滴度的病毒载体，在基因治疗和免疫领域有更多的应用。
图 1 病毒载体在基因市场的应用
（Source: EvaluatePharma, July 2021）
表1 常用的病毒载体
AAV简介
AAV是一种基因组DNA小于5 kb的单链线性DNA缺陷病毒，其结构为二十面体非包膜粒子AAVE币。AAV由一个具有反末端重复序列的单链DNA和两个两端的开放阅读框Rep和Cap组成。IRT是对称重复序列，在AAV的结构和功能中起重要作用。Rep基因由4个重叠基因Rep78、Rep68、Rep52和Rep40组成，可编码AAV复制、包装和基因组整合所需的Rep蛋白。Cap是编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，衣壳蛋白的比例为1:1:10(VP1:VP2:VP3)。这三个分子相互作用形成一个对称的二十面体结构，作为基因传递的载体（图2）。
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图 2 AAV基因组结构示意图
腺病毒首次被发现是在1960年实验室，之后再人体组织中被检测到AAVE币。腺病毒并不会损伤人体组织，它的生命周期与协同病毒相关（图3），在腺病毒(Ad)、单纯疱疹病毒病毒(HSV)或人乳头瘤病毒(HPV)协同下进行复制和组装产生病毒粒子。由于重组外生体DNA不会整合到宿主基因组中，因此随着细胞经历重复的重复复制，它最终会随着时间的推移而被稀释，这些特性使rAAV成为某些基因治疗应用的理想选择。
图 3 腺病毒生命周期
AAV应用
近年来，AAV在肿瘤疾病的治疗中显示出巨大的价值AAVE币。AAV作为基因治疗的载体已在肺、肝、眼、脑、肌肉等多个临床试验(超过100次)中得到应用，并在盲症和血友病方面取得了巨大成功。
2012年，AAV1载体编码的脂蛋白脂肪酶成为欧盟批准的首个用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症的基因治疗产(Glybera)AAVE币。
2017年，另一种AAV2介导的基因治疗药物(Luxturna，Roche)随后获准在美国上市AAVE币。
Grifman等人通过插入NGR多肽基元来设计AAV2衣壳，使得AAV2能够更高效、更特异性地将治疗药物传递给肿瘤细胞AAVE币。
腺病毒在基础和实验研究有这么强的生命力原因在于：宿主范围广，对人致病率低；腺病毒粒子相对稳定，病毒基因重排频率低；安全性高，不整合到染色体中，无插入致病基因，不干扰其他宿主基因AAVE币。
AAV生产流程简介
AVV的生产流程跟抗体、疫苗类药物的生产类似，主要包含上游培养、下游纯化以及制剂部分（图4）AAVE币。
图 4 AVV 生产流程
3.1. 上游培养
生产高滴度病毒是在研发过程中首要关注的点，而商业化生产则要求：产品质量优先、具有可复制、可放大性AAVE币。
一般上游包括以下几个过程：
大量的细胞培养是产生基因所必需的，而瞬态转染是目前流行的一种方法，但是往往是更难以扩大规模AAVE币。为了使这一过程在商业上可行，以最大限度地提高生产率，减少进一步扩大规模和相对质粒的消耗。科学家可以转向其他系统，如辅助病毒介导转染或昆虫细胞平台。
3.2. 下游纯化
病毒生产流程的后半部分需要从工艺和产品相关的杂质中纯化病毒颗粒AAVE币。这些下游处理步骤可能占病毒生产总成本的很大一部分，因此高效地产生高纯度病毒是非常重要的。一般下游操作主要包括：
3.2.1.细胞裂解
从细胞中释放AAV载体的基本机械技术是反复冷冻/解冻，然后是低速离心步骤然而，但是这种技术很难放大生产AAVE币。机械均质，如法式压滤，是另一种裂解方法，在这种方法中，细胞膜在高压剪切力作用下发生破裂。虽然这种方法是可放大的，但是由于剪切应力引起的聚集和沉淀，往往会导致产品损失。而化学裂解方式，例如Triton X-100在病毒载体纯化过程有较高的总收率，而且易于放大。但是也有其局限性。研究表明，Triton X-100造成了一些急性口服毒性、眼睛损伤、皮肤刺激和慢性水生毒性。因此，该去垢剂在2016年被欧洲化学品管理局（European Chemicals Agency）被列为需要高度关注的物质。
3.2.2.过滤
过滤是AAV下游处理中最昂贵的单元操作AAVE币。在过滤过程中，由于剪切应力的作用，可导致AAV颗粒聚集或失去功能。优化过滤以实现高通量回收腺病毒仍然是一个挑战，因为它也取决于被处理的AAV血清型。目前，连续过滤作为一种分离技术可能会减少过滤器堵塞，但行业尚未实施这项技术。另外，在过滤过程中存在较大的滞留量和产品损失也是一个问题。
3.2.3.纯化
典型的色谱方法包括亲和层析和离子交换层析(IEC)AAVE币。虽然亲和层析法能够产生高纯度的AAV，但它不能区分空的和完整的病毒衣壳。下游纯化最大的挑战之一是，满足每个AAV血清型特定的纯化方法，以实现最佳产量，同时保持产品的效力和完整性。
3.3. 最终制剂
AAV载体的制剂目标包括在储存货架期保持载体的稳定性和活性，并在体内实现最佳的靶组织转导AAVE币。制剂工艺主要包括：
（1）配方设计（2）切向流(TFF)浓缩和过滤AAVE币。
处方开发工作包括确定缓冲液和pH值，使其具有最大的稳定性，然后筛选赋形剂以获得最佳的稳定性和有效性，这些研究包括在的强制降解实验AAVE币。典型的强制降解实验：加速温度、冻融、光照、低pH值和高pH值、剪切应力、强制氧化和脱酰胺。
AAV生产面临的挑战的解决方案
综合AVV制备的三个工艺阶段介绍，可以看出下游处理可以占病毒生产总成本的很大一部分，而且难度也是非常大，尤其是纯化过程AAVE币。
原因之一是由于有超过100种不同的变体AAV衣壳，不同血清型的AAV蛋白存在差异AAVE币。因此，各种血清型的表面特性增加AAV纯化难度。
原因之二是：针对工艺和产品相关的杂质（包括宿主细胞物质，DNA和空衣壳），缺乏一个有效和可重复的平台方法，尤其是来从空衣壳中分离出完整的衣壳AAVE币。
所以AAVE币，为了解决以上问题，国内外大的药企公司都致力于纯化新产品的开发，以期达到：
（1）实现病毒颗粒的分离
（2）减少产品相关杂质
（3）保持效力和产量的目标
赛多利斯的BIA整体柱技术在AAV的下游纯化中表现尤其突出，下面将以实际的案例进行展示AAVE币。
4.1.1. 三步&两步层析纯化
BIA整体柱提供如下解决方案：将细胞裂解液在去除细胞碎片后直接进行3柱纯化，即利用CIMmultus OH疏水色谱得到初始病毒捕获和纯化AAVE币。
之后经过CIMmultus SO3和 CIMmultus QA达到精纯，具体实验过程参见图5AAVE币。如果前期经过UF/DF处理，也可以直接采用CIMmultus SO3进行捕获，然后通过CIMmultus QA进行精纯。
图 5 CIMmultus OH结合CIMmultus SO3
和 CIMmultus QA纯化过程
用该方法不仅获得较高的回收率，而且有效分离空壳和完整病毒颗粒AAVE币。使用BIA整体柱纯化的产品纯度与ICGEB实验室纯化产品纯度相当 （图6）。
图 6 SDS-PAGE：SyproRuby染色
4.1.2. CIMmultus QA单步层析纯化
采用CIM ® 离子交换层析整体柱分离AAV8空壳和完整颗粒的，其色谱图和EM图像见图7，方法见表2AAVE币。结果显示：将1.29E+12 GC 经亲和纯化的 AAV8 上样至 CIMmultus QA (1 mL)，在第2个峰回收了1.05E+12 GC 的AAV8，回收率为80%。EM 图像显示，空壳富集在第1个峰（图7-中图），而完整病毒颗粒则集中在第2个峰（图7-右图）。
图 7 CIMmultus QA 纯化图谱
表 2 阴离子交换材料与方法
展望
基因疗法制造商今天面临的挑战与抗体疗法刚出现时单克隆抗体制造商面临的挑战相似AAVE币。例如，在生产、储存和处理过程中，单克隆抗体也会受到低滴度、产品和工艺相关杂质和降解的挑战。尽管与重组单克隆抗体相比，单剂量AAV产品与工艺相关杂质相关的风险可能更低（取决于杂质的类型、剂量和给药途径），但这也不能忽视。
由于这些相似性，制药商、化学品和辅料供应商有机会进行合作，并开发创新的解决方案，以实现稳健和成本效益高的AAV产品生产AAVE币。
参考文献
1）Santiago-Ortiz JL, Schaffer DV. Adeno-associated virus (AAV) vectors in cancer gene therapy. J Control Release. 2016;240:287–301.
2）Luo J, Luo Y, Sun J, Zhou Y, Zhang Y, Yang X. Adeno-associated virus-mediated cancer gene therapy: current status. Cancer Lett. 2015;356(2 Pt B):347–56.
3）Li C, Bowles DE, van Dyke T, Samulski RJ. Adeno-associated virus vectors: potential applications for cancer gene therapy. Cancer Gene Ther. 2005;12(12):913–25.
4） Luo J, Luo Y, Sun J, Zhou Y, Zhang Y, Yang X. Adeno-associated virus-mediated cancer gene therapy: current status. Cancer Lett. 2015;356(2 Pt B):347–56.
5）F. Smrekar, A. Podgornik, M. Ciringer, S. Kontrec, P. Raspor, A. Štrancar, M. Peterka, Preparation of pharmaceutical-grade plasmid DNA using methacrylate monolithic columns, Vaccine 28 (2010) 2039–2045.
6) BIA Separations 应用说明书
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